Western blot基本原理：

在電場的作用下將電泳分離的多肽從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。

Western blot應(yīng)用：

目的蛋白的表達(dá)特性分析；

目的蛋白與其他蛋白的互作；

目的蛋白的組織定位；

目的蛋白的表達(dá)量分析；

Western blot一般流程：

蛋白樣品的制備：

1 水溶液提取法：稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解  度大，是提取蛋白質(zhì)常用的的溶劑，操作相對麻煩，重復(fù)性一般；

2 有機(jī)溶劑提取法；

3 離心管柱提取法：超快速，易用，高產(chǎn)及重復(fù)性強(qiáng)；

4 通過層析或電洗脫法制備目的蛋白。

Western blot注意事項和常見問題：

1 我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

答：有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長； 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。

2 我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0 KD），請問怎么做WB？

答：可以選擇0.2 μm的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。

3 最后顯色時用 DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級蛋白，具體可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)的情況。

4 要驗(yàn)證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個試驗(yàn)時的一抗和二抗可以共用嗎？

答：①免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western  blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定 量，但是不能定位。

   ②兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

5 細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？

答：一般5×10⁶就足夠了。

6 同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？

答：能，沒有問題。

7 同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？

答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

8 蛋白變性后可以存放多久？

答：－80℃，一兩年沒有問題。關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。

9 二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？

答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼兀茫拢樱链鎽?yīng)該好一點(diǎn)。

10 做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？

答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性。

11 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。

12 在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。

13 檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

答：可以。

14 蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。

15 細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？

答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。若有特殊要求可以選擇相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。

16 PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。

17 westernblot內(nèi)參選擇什么合適？

答：這與目標(biāo)抗原的表達(dá)位置有關(guān)，對于胞漿和全細(xì)胞蛋白，可選擇內(nèi)參β-actin、GAPDH和Tubulin；線粒體蛋白則可選擇內(nèi)參VCDA1/Porin和COXIV；核內(nèi)抗原可以選擇內(nèi)參Lamin B1、TBP和histone。

18 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低？

答：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20% 甲醇（終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉(zhuǎn)移效率；使用戊二醛交聯(lián)；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉(zhuǎn)膜電壓/電流，增加轉(zhuǎn)移時間。

19 轉(zhuǎn)膜時凝膠腫脹或卷曲？

答：可將凝膠在轉(zhuǎn)膜前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min。

20 跑膠的條帶歪斜或者漂移？

答：電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致，可更換或者在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。

21 轉(zhuǎn)膜后膜上有單個或多個白點(diǎn)？

答：轉(zhuǎn)膜時確保膜和膠塊之間沒有氣泡。

22 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？

答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過高，轉(zhuǎn)膜過程中注意降溫。

23 顯影后膠片背景太高？

答：轉(zhuǎn)膜前PVDF膜沒有用100%甲醇完全浸濕；洗膜不充分，可以增加膜洗滌次數(shù)；封閉不完全，選擇合適的封閉液和提高封閉時間；二抗?jié)舛冗^高，降低二抗?jié)舛龋灰豢固禺愋圆粡?qiáng)，換用特異性較強(qiáng)的單克隆抗體；曝光時間過長，減少曝光時間。

24 結(jié)果沒有條帶或者條帶很淺，雜交信號很弱？

答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上樣量，設(shè)置已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對照；抗體稀釋比例太低，孵育時間不夠；轉(zhuǎn)膜不好，轉(zhuǎn)膜后可先用麗春紅染色觀看染色效果；曝光時間過短，增加曝光時間；抗體保存不當(dāng)，效價降低。

25 目的條帶位置偏低或者偏高？

答：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。

26 有非特異性條帶？

答：目的蛋白有多個修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特異性引起的結(jié)果，可設(shè)立一組不加一抗只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異性結(jié)合；樣品蛋白質(zhì)可能降解，提取蛋白時注意冰上操作，加入適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?，避免樣品反?fù)凍融；抗體濃度過高，降低一抗和二抗的濃度。

27 膠片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。     二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；二抗失活。

28 目的條帶是白色，周圍有背景？

答：目的蛋白含量太高；一抗?jié)舛绕?，二抗上HRP催化活力太強(qiáng)。